總的原則：無菌操作、保-證細胞培養環境的穩定性
按時間順序整理
1、 細胞房和生物安全柜（或超凈工作臺）先開紫外照射30min。作用：對環境滅菌（空氣）。（備注：如果著急，至少也要開15分鐘）
在做實驗之前考慮好需要哪些物品。開始照射之前，將所需要用到的物品都放到生物安全柜（或超凈工作臺）里面。
常用移液槍或電動移液器等，需要在工作臺上放置一套專用設備。
細胞培養箱一般都已經調整好。定期留意一下二氧化碳是否足夠。不夠及時更換。
2、 顯微鏡需要定期消毒酒精擦拭。注意：顯微鏡一般都放在細胞房。
3、 進入實驗之前，首先給自己帶上拖鞋、頭套，口罩，實驗服，手套（手套帶雙層）。注意：手套要將袖口套進去。實驗服、拖鞋*-好是細胞房專用。
4、 開始操作之前先觀察細胞。
首先觀察細胞培養液的顏色?，F在的細胞培養液通常都放有酸堿指示劑（絕大部分是酚紅）。細胞在培養生長過程中，不斷在培養液上清中累積酸性物質，時間長了，培養液變為黃色（同時培養液中營養物質耗盡）。
其次鏡下觀察細胞的生長狀態是否良好，是否需要傳代。如果生長狀態不好，需要對培養液進行調整（一般是加大血清濃度）。過于密集出現大片融合或太密集而導致細胞脫落，則進行傳代。
如果長勢良好，且細胞培養液顏色未發生變化，可以酌情進行1/2、 1/3、1/4換液，也可以全換液?？傊?，視細胞生長情況而定。
5、 細胞培養預準備：
首先是準備各種溶液。
第 一是配制溶液過程中要用到的水。水用純水，高壓滅菌之后，再去內毒素。去內毒素方法很多，*簡單可以放在烘箱180度3小時?；蛘哌^去內毒素的柱子后，高壓滅菌。
第二，各種溶液滅菌：
抗生素用去內毒素水配制后，直接過濾除菌（過0.22u濾頭）?？梢杂靡淮涡詿o菌注射器過一次性0.22u濾頭。
現在用的培養液，如果是商業化液體培養基，不用處理。如果是粉末，需要用去內毒素水在生物安全柜（或超凈工作臺）進行配制，再過濾除菌?？梢韵扰錆饪s液（如10×），過濾除菌后。再用滅菌去內毒素水稀釋成1×培養液。
第三，完-全培養液的配制：
培養液加上合適比例的血清即可。但血清一般保存于－20℃，一般解凍是放在4℃冰箱解凍，耗時長，而且必須解決完-全之后，才能進行完-全培養基的配制。所以要提前幾個小時就將血清從－20℃轉入4℃，以期完-全解凍。當然如果這一次就需要用完的話（是指用這些血清配制的培養液都用完），也可以放到37℃解凍。
第四，*重要的是保-證過程中無菌。
液體必須要分裝。無論過程中用到的培養液、胰酶、血清、PBS、生理鹽水、抗生素盡量分裝。分裝是為了防止污染。如果操作有誤，僅能威脅到其中一支，而非整個。
培養液、血清、PBS、生理鹽水分裝為20mL、50mL或100mL/管
胰酶、抗生素可分裝為1mL/管。
分裝*-好先于細胞操作
第五，操作之前，培養液先放到37度的細胞培養箱里復溫。原因：盡量減少對細胞的刺激。低溫對于細胞也是一個刺激因素。
第六，操作之前，大腦先過一遍此次操作所需要用到的所有用具。將所有用具先放到無菌臺面上。減少拿入拿出的動作，保-證無菌。（如果萬一發現少拿了什么，也不要緊，再加上就是。如果是槍頭盒、移液管等用具，*-好先用消毒酒精噴一下）。
第七，操作之前，帶著的手套先噴消毒酒精。然后再進入工作臺。等一分鐘，等手套上的酒精揮發之后再進行操作。
6、 細胞培養操作過程：
注意無菌。無論哪一管液體，開蓋后盡量立即關上（如果有幾瓶都需要開的，也注意，可以虛蓋）。蓋子向上放。操作時不要從開蓋的容器上方經過。另外，無菌臺面上擺放的各種東西，*-好是一字擺開，平行于自己。盡量不要前后重疊。
細胞操作中所用的所有耗材試劑*-好都是細胞培養專用。一般都以一次性耗材居多。1ML槍頭為加長型專用培養槍頭。移液管亦有專用10mL一次性無菌移液管
（1）細胞換液：
培養皿/瓶用槍頭或移液管吸去原培養液，加入新培養液。
（2）細胞傳代：
傳代之前先觀察，細胞是否密集，是否開始融合。一般融合達到70－80%就可以傳代。早點傳代也可以。
如果是貼壁生長的細胞：
1） 培養皿/瓶用槍頭或移液管吸去原培養液；
2） 無菌PBS或無菌生理鹽水洗滌3次（按培養體積加入）；
3） 加入適量胰酶消化適當時間（一般胰酶為0.25%；9cm/10cm培養皿和25cm培養瓶，一次加入1mL胰酶。消化時間視細胞類型等多種情況綜合考慮，一般如果是細胞株，非原代培養，消化1－2分鐘足矣）；
4） 用槍頭吹打數十次（視細胞類型而定。一般細胞株30－50次吧，耗時一般2分鐘左右）；
5） 加入適量體積完-全培養基終止胰酶消化（如果是9cm/10cm培養皿和25cm培養瓶，可以加入1mL完-完-全培養基；現在培養瓶（皿）里有2mL溶液）。
6） 現在可以將溶液進行分瓶（2mL）。如果是細胞株，直接均分到兩個培養瓶（皿）里。如果是原代培養，可以根據消化時間來對細胞進行分離；因此可以將溶液（2mL）都轉入新的培養瓶（皿）。
7） 將兩個培養瓶（皿）補足完-全培養基到正常體積（果是9cm/10cm培養皿和25cm培養瓶，為5mL完-全培養液）
8） 鏡下觀察。剛剛傳代細胞還沒貼壁，懸浮在溶液中，呈圓形。一般2h之內會貼壁，如果已經貼壁，根據細胞類型有不同的形態，但通常都不是圓形。
9） 鏡下觀察無誤之后，再放入細胞培養箱。培養瓶（皿）放入之前，可以用消毒酒精先擦一下。
10） 傳代之后，*-好第二天細胞換液一次。當然，也可以視情況而定。
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