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細胞培養的注意事項

點擊次數:1280   發布時間:2024/4/16 17:30:23

 總的原則:無菌操作、保-證細胞培養環境的穩定性

 
按時間順序整理
 
1、 細胞房和生物安全柜(或超凈工作臺)先開紫外照射30min。作用:對環境滅菌(空氣)。(備注:如果著急,至少也要開15分鐘)
 
在做實驗之前考慮好需要哪些物品。開始照射之前,將所需要用到的物品都放到生物安全柜(或超凈工作臺)里面。
 
常用移液槍或電動移液器等,需要在工作臺上放置一套專用設備。
 
細胞培養箱一般都已經調整好。定期留意一下二氧化碳是否足夠。不夠及時更換。
 
 
 
2、 顯微鏡需要定期消毒酒精擦拭。注意:顯微鏡一般都放在細胞房。
 
 
 
3、 進入實驗之前,首先給自己帶上拖鞋、頭套,口罩,實驗服,手套(手套帶雙層)。注意:手套要將袖口套進去。實驗服、拖鞋*-好是細胞房專用。
 
 
 
4、 開始操作之前先觀察細胞。
 
首先觀察細胞培養液的顏色,F在的細胞培養液通常都放有酸堿指示劑(絕大部分是酚紅)。細胞在培養生長過程中,不斷在培養液上清中累積酸性物質,時間長了,培養液變為黃色(同時培養液中營養物質耗盡)。
 
其次鏡下觀察細胞的生長狀態是否良好,是否需要傳代。如果生長狀態不好,需要對培養液進行調整(一般是加大血清濃度)。過于密集出現大片融合或太密集而導致細胞脫落,則進行傳代。
 
如果長勢良好,且細胞培養液顏色未發生變化,可以酌情進行1/2、 1/3、1/4換液,也可以全換液?傊,視細胞生長情況而定。
 
 
 
5、 細胞培養預準備:
 
首先是準備各種溶液。
第 一是配制溶液過程中要用到的水。水用純水,高壓滅菌之后,再去內毒素。去內毒素方法很多,*簡單可以放在烘箱180度3小時;蛘哌^去內毒素的柱子后,高壓滅菌。
 
第二,各種溶液滅菌:
 
抗生素用去內毒素水配制后,直接過濾除菌(過0.22u濾頭)?梢杂靡淮涡詿o菌注射器過一次性0.22u濾頭。
 
現在用的培養液,如果是商業化液體培養基,不用處理。如果是粉末,需要用去內毒素水在生物安全柜(或超凈工作臺)進行配制,再過濾除菌?梢韵扰錆饪s液(如10×),過濾除菌后。再用滅菌去內毒素水稀釋成1×培養液。
 
第三,完-全培養液的配制:
 
培養液加上合適比例的血清即可。但血清一般保存于-20℃,一般解凍是放在4℃冰箱解凍,耗時長,而且必須解決完-全之后,才能進行完-全培養基的配制。所以要提前幾個小時就將血清從-20℃轉入4℃,以期完-全解凍。當然如果這一次就需要用完的話(是指用這些血清配制的培養液都用完),也可以放到37℃解凍。
 
第四,*重要的是保-證過程中無菌。
 
液體必須要分裝。無論過程中用到的培養液、胰酶、血清、PBS、生理鹽水、抗生素盡量分裝。分裝是為了防止污染。如果操作有誤,僅能威脅到其中一支,而非整個。
 
培養液、血清、PBS、生理鹽水分裝為20mL、50mL或100mL/管
 
胰酶、抗生素可分裝為1mL/管。
 
分裝*-好先于細胞操作
 
第五,操作之前,培養液先放到37度的細胞培養箱里復溫。原因:盡量減少對細胞的刺激。低溫對于細胞也是一個刺激因素。
 
第六,操作之前,大腦先過一遍此次操作所需要用到的所有用具。將所有用具先放到無菌臺面上。減少拿入拿出的動作,保-證無菌。(如果萬一發現少拿了什么,也不要緊,再加上就是。如果是槍頭盒、移液管等用具,*-好先用消毒酒精噴一下)。
 
第七,操作之前,帶著的手套先噴消毒酒精。然后再進入工作臺。等一分鐘,等手套上的酒精揮發之后再進行操作。
 
 
 
6、 細胞培養操作過程:
 
注意無菌。無論哪一管液體,開蓋后盡量立即關上(如果有幾瓶都需要開的,也注意,可以虛蓋)。蓋子向上放。操作時不要從開蓋的容器上方經過。另外,無菌臺面上擺放的各種東西,*-好是一字擺開,平行于自己。盡量不要前后重疊。
 
細胞操作中所用的所有耗材試劑*-好都是細胞培養專用。一般都以一次性耗材居多。1ML槍頭為加長型專用培養槍頭。移液管亦有專用10mL一次性無菌移液管
 
(1)細胞換液:
 
培養皿/瓶用槍頭或移液管吸去原培養液,加入新培養液。
 
(2)細胞傳代:
 
傳代之前先觀察,細胞是否密集,是否開始融合。一般融合達到70-80%就可以傳代。早點傳代也可以。
 
如果是貼壁生長的細胞:
 
1) 培養皿/瓶用槍頭或移液管吸去原培養液;
 
2) 無菌PBS或無菌生理鹽水洗滌3次(按培養體積加入);
 
3) 加入適量胰酶消化適當時間(一般胰酶為0.25%;9cm/10cm培養皿和25cm培養瓶,一次加入1mL胰酶。消化時間視細胞類型等多種情況綜合考慮,一般如果是細胞株,非原代培養,消化1-2分鐘足矣);
 
4) 用槍頭吹打數十次(視細胞類型而定。一般細胞株30-50次吧,耗時一般2分鐘左右);
 
5) 加入適量體積完-全培養基終止胰酶消化(如果是9cm/10cm培養皿和25cm培養瓶,可以加入1mL完-完-全培養基;現在培養瓶(皿)里有2mL溶液)。
 
6) 現在可以將溶液進行分瓶(2mL)。如果是細胞株,直接均分到兩個培養瓶(皿)里。如果是原代培養,可以根據消化時間來對細胞進行分離;因此可以將溶液(2mL)都轉入新的培養瓶(皿)。
 
7) 將兩個培養瓶(皿)補足完-全培養基到正常體積(果是9cm/10cm培養皿和25cm培養瓶,為5mL完-全培養液)
 
8) 鏡下觀察。剛剛傳代細胞還沒貼壁,懸浮在溶液中,呈圓形。一般2h之內會貼壁,如果已經貼壁,根據細胞類型有不同的形態,但通常都不是圓形。
 
9) 鏡下觀察無誤之后,再放入細胞培養箱。培養瓶(皿)放入之前,可以用消毒酒精先擦一下。
 
10) 傳代之后,*-好第二天細胞換液一次。當然,也可以視情況而定。
 

原創作者:上海信帆生物科技有限公司

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